WP2: Caratterizzazione dei miRNA via ESI-MS, come biomolecole singole e in complessi miRNA-target.

La Dr.ssa A. Cartoni (Sapienza Università di Roma), con la sua consolidata esperienza nell'uso e sviluppo di tecniche MS e modifiche di strumentazioni commerciali, studi di reattività in fase gassosa e preparazione e caratterizzazione di nuove molecole e nanomateriali per il settore biomedico sarà la responsabile del WP. Al WP partecipano P.Bolognesi, L. Avaldi (CNR-ISM) e l’assegnista di ricerca 2. Questa attività prevede una collaborazione con OdR esterni alla regione: Phys. Dept. University of Stockholm (M. Stockett) per la produzione/caratterizzazione del fascio di ioni molecolari.
Le finalità del WP2 sono: definizione delle condizioni sperimentali per preparare fasci di ioni molecolari di miRNA ottimizzazione delle tecniche di analisi chimico-fisica e di caratterizzazione in termini di rapporto m/z dei miRNA nativi, valutazione dell’applicabilità della tecnica ESI-MS per l’identificazione ed estrapolazione delle informazioni sulle “strutture tipo” delle biomolecole e loro variazioni “in-operando”. La fragilità e scarsa stabilità dei materiali biologicamente attivi limita il numero di tecniche utilizzabili per produrre analisi accurate e affidabili. Recenti studi hanno dimostrato la compatibilità dell’ESI-MS con le condizioni necessarie per valutare biomolecole in condizioni native [7] da sole e in complesso con altre molecole. BioDiveErSI utilizzerà la nuova strumentazione per valutare le forze di legame dei complessi miRNA e molecole target, analisi importante per a) distinguere le interazioni specifiche da quelle non specifiche [8], b) determinare il tipo di interazione in base alla loro composizione e struttura. Il laboratorio chimico a disposizione del gruppo e il set-up ESI per deposizioni a temperatura e pressione ambiente sviluppato nell’ambito del precedente progetto DESIR saranno utilizzati per il task 2.1 e il sistema sviluppato nel WP1 per gli altri task.
Questo WP si articola in 3 task:
Task 2.1 . Effetto di solventi e additivi utilizzati nella soluzione del miRNA modello e ottimizzazione delle condizioni della loro caratterizzazione. 
La composizione delle soluzioni in cui verrà analizzato il miRNA gioca un ruolo fondamentale nell’efficienza del processo ESI e sulla formazione del complesso del miRNA e molecole target. I solventi verranno scelti sulla base della loro biocompatibilità e capacità di solubilizzare le biomolecole senza inficiarne la stabilità e permettere un’efficiente produzione del fascio di ioni. In questa attività, diverse sequenze modello di miRNA, con lunghezze nell’intervallo 16-24 nucleotidi, verranno analizzati tenendo conto dei diversi parametri che riguardano 1) il set-up dello strumento (sezione dell’ago, tensione, flusso, geometria del sistema ESI, pressione nella sorgente ESI), 2) le caratteristiche della soluzione (concentrazione, tipo di soluzione, pH, forza ionica, presenza e quantità di additivi). Verranno studiate le diverse isoforme e strutture di miRNA modello che producono diverse distribuzioni nei rapporti m/z. 
Task 2.2  Caratterizzazione del complesso miRNA-target ed estrapolazione dei rapporti m/z del complesso. 
L’ attività prevede lo studio via ESI- MS dei miRNA modello con molecole target, quali le proteine Ago in soluzioni e/o sequenze nucleotidiche complementari, nelle condizioni sperimentali testate nell’attività 2.1. La maggior parte dei complessi RNA-DNA e/o RNA-proteine sono basati su interazioni elettrostatiche, di cui è necessaria un’approfondita analisi della formazione del complesso in condizioni native. L’uso di ESI accoppiata alla MS consentirà un’analisi dei rapporti di m/z relativi ai campioni analizzati in un range di concentrazione che va dal nM al fM
[8]. La valutazione preliminare su singole biomolecole consentirà di prevedere 1) la struttura delle molecole durante le interazioni, 2) le interazioni elettrostatiche e 3) la possibile stechiometria del complesso. 
Task 2.3  Valutazione delle interazioni. 
In base ai risultati delle attività 2.1 e 2.2, le interazioni di legame di una sequenza specifica di miRNA verranno analizzate in presenza di un insieme di biomolecole (tra cui la proteina Ago2 della famiglia delle argonaute, di cui è nota la specificità di legame miRNA-Ago2 [9]), con cui il miRNA interagisce con diverso grado di affinità. Questi studi saranno condotti in soluzioni tampone tale da consentire l’analisi dei complessi senza interferenze. Inoltre, l’ESI-MS in condizioni native offrirà la possibilità di determinare le costanti di legame del complesso di miRNA e targets. I dati sperimentali, relativi ai rapporti m/z degli stati di
ionizzazione delle molecole singole e sottoforma di complesso, verranno confrontati con quelli teorici ottenuti dalle attività 3.1 e 3.2 del WP3. Questo consentirà la costruzione di un data-base per l’analisi dei possibili complessi presenti in campioni reali.